서 론

선체의 생물부착(biofouling)은 연료 소비를 증가시키고 선박의 운항 속도를 감소시켜 연료 소비량이 최대 40%까지 증가하며 선체 구조에도 심각한 손상을 입힐 수 있다(Champ, 2000). 일반적으로 이를 최소화하기 위한 사전 예방법으로는 방오시스템(antifouling system)을 선체 표면에 처리하여 생물 부착을 사전에 최소화시키고, 사후 예방법으로 선체를 주기적으로 수중 또는 Dry dock에서 브러쉬나 워터젯과 같은 기계적인 방법을 사용하여 생물 및 막을 제거하는 방법이 활용되고 있다 (Chambers et al., 2006;Almeida et al., 2007). 방오시스템은 선체 표면에 처리된 후 살생물질(살충제, 제초제 등)을 수중으로 서서히 방출하여 생물학적 부착을 방지하는 원리를 가지고 있다. 그러나, 주기적인 선체 표면의 페인트 작업, 방오생물 제거 과정을 통해 여과없이 연안 환경에 배출되고 있다. 방오페인트는 다양한 살충 효과를 가진 중금속을 포함한 화합물질로서, 페인트 화합물의 조성은 제조회사와 선주사의 협의에 따다 선박마다 다양하여 실제 해양에서 청소작업을 통해 유출되는 배출수의 영향에 대한 보고는 매우 제한적이다.

전 세계적으로 시행되고 있는 대표적인 선체 청소방법으로는 육상(Dry dock)에서 브러쉬나 워터젯을 이용한 작업과 부두에서 접안하고 있는 선체에 다이버나 로봇청소시스템이 수중에서 직접 부착생물을 제거하는 방법이 시행되고 있다. 그러나 이 두가지 모두 작업과정 중 발생되는 화학적 유해물질을 처리하는 규제는 현재 국가적으로 마련중이며, 선체청소배출수에 대한 생물영향에 대한 관심이 증가되고 있다. 비표적 생물에 독성 영향을 미칠 수 있다고 보고되고 있다(Dafforn et al., 2011). 최근 연구에서는 선체 청소 과정에서 발생하는 방오페인트 입자는 해안 퇴적물에서 중금속 오염의 원인으로 확인되었으며, 고농도의 구리 및 아연이 주류를 이루고 있다고 보고하고 있다(Holms and Turner, 2009;Singh and Turner, 2009a;2009b). 경골어류에서는 구리와 아연 등의 개별 중금속 노출에 대한 성장 감소 (McGeer et al., 2000), 산화스트레스(Eyckmans et al., 2011, McRae et al., 2016), 이온 조절 장애(McRae et al., 2016), 항상성 장애, 면역 체계 변화(Wang et al., 2020), 효소 억제 및 대사 장애와 같은 생화학적 및 생리학적 변화를 일으키는 것으로 보고되고 있다. 그러나, 실제 현장의 선체청소배출수에 노출된 해양생물별 독성영향결과는 부족한 실정이며 대부분의 연구는 특정 살충성분의 방오물질의 영향을 보고하고 있다.

본 연구에서는 넙치 배아에 대한 선체청소배출수에 노출된 발생독성 영향을 조사하였다. 이 연구에 사용된 넙치(Paralichthys olivaceus)는 한국, 일본, 중국을 포함한 동아시아와 남아시아의 중요한 양식종 중 하나로 이전 연구를 통해 화학물질의 노출에 민감한 생물종으로 알려져 있다. 또한 부유성 수정란으로 해양의 수층오염물질 노출에 취약하다. 일반적으로 어류 생애주기 독성 평가에서는 대부분의 경우 배아 단계와 치어단계가 화학물질 노출에 가장 민감한 반응을 보이는 것으로 보고되고 있어(McKim, 1977), 전 세계적으로 수정란을 이용한 독성평가는 화학물질 노출 실험으로부터 민감한 어류 독성을 검출하기 위한 유용한 생애 단계로 활용되고 있다(Oris et al. 2012; Scholz et al. 2013b).

따라서 본 연구에서는 선체청소배출수가 넙치 배아의 발생 및 발달 과정에 미치는 영향을 사망률과 기형 발생, 형태발생관련 유전자발현을 통해 이해하고, 전사체 분석을 통해 독성 영향 메커니즘을 규명하였다. 전세계적인 방오시스템 협약(The Antifouling System Convention; AFS)은 수중 오염을 예방 하거나 감소시키기 위해 적절한 방오성 폐기물 관리의 중요성을 강조하고 있다(IMO, 2008). 본 연구결과는 연안 서식 생물의 선체청소배출과 관련된 독성 영향을 입증하여 선체청소배출물 처리와 관리를 위한 과학적 의사 결정을 지원하는 데 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

재료 및 방법

1. 선체청소배출수 채집

선체청소배출수(In-water cleaning wastewater, IWC wastewater) 시료 채집은(2022년 06월 20일, HMM Southampton, 약23만톤) 선박 유지보수기간에 잠수부가 직접 바다에 입수하여 수행되었다. 잠수부는 선체에 50 × 50 ㎝ 크기의 방형구를 부착한 뒤, 브러쉬로 선체 표면을 청소하면서 발생하는 선체청소배출수를 방형구에 따라 펌프로 흡입하여 200 L 대형 물통에 샘플링을 진행하였다. 일정하게 샘플을 분주하기 위해 원수(wastewater)를 지속적으로 섞어주면서 HDPE 재질의 20 L 컨테이너에 분주한 후 시료 정보를 명확하게 표기하여 한국해양과학기술원 연구실로 운반하였다. 연구실로 운반한 원수는 시료 내의 입자들이 균일하게 분주 될 수 있도록 잘 흔들어서 4 L 채수병으로 분주하였다. 선체청소배출수는 원수 (wastewater, W)와 0.45 ㎛ PES membrane filter (JetBiofil®, Guangzhou, China)로 여과한 실험실 여과 선체청소배출수(Lab filter wastewater; LF)로 분리하여 실험 전까지 –20℃에서 보관하였다.

2. 선체청소배출수 화학성분분석

선체청소배출수 내의 용존 금속 분석을 위해 원수를 0.45 μm 필터로 여과하였다. 여과액은 1N HNO3을 사용하여 pH2 이하로 산성화한 후 EPA 200.8 (USEPA, 1994) 방법에 따라 유도 결합 플라즈마 질량 분석(ICP-MS; iCAP RQ, Thermo Fisher Scientific, Germany)을 통해 분석을 수행하였다. ICP-MS 분석 전에는 seaFAST SP3 시스템(ESI, Portland, OR, USA)을 사용하여 해수 매트릭스를 제거하고 미량 금속을 농축하였다. ICP-MS의 운영 조건은 Soon et al. (2021)에서 자세히 설명되어 있다. 1% 질산 용액을 사용하여 ICP-MS 시스템을 세척하고 안정적인 작동 조건을 유지하였다. 시스템은 튜닝 용액을 사용하여 최적화한 후 0.05–40 μg/L 농도의 표준 용액으로 교정하였고, 처리된 시료를 주입하고 각 원소에 해당하는 피크의 강도를 측정하여 설정된 검량선을 기반으로 정량화 하였다. 분석의 정확성을 보장하기 위해 캐나다 국립 연구 협회 표준물질인 CASS-6을 시료와 함께 분석하였으며, 이 표준 물질로부터 회수된 금속은 97-125% 범위였다.

3. 선체청소배출수 scanning electron microscope (SEM) 관찰

선체청소배출물 시료를 방오도료 입자만 남을 때까지 상온에서 48시간동안 공기 건조한 후 sputter coater(Cressington Sputter Coater 108, Watford, UK)를 사용하여 10 mA에서 120초 동안 백금(platinum) 이온으로 코팅하였다. 그리고 주사 전자현미경(JSM 7600-F, JEOL, Japan)으로 방오도료 입자를 관찰하였다.

4. 실험생물 및 독성시험

실험에 사용된 넙치 수정란은 ㈜해연(제주, 대한민국)에서 인공수정 된 수정란을 구입하였다. 수정 후 6시간이 지난 수정란을 한국해양과학기술원 남해연구소 양식동으로 옮겨 수온 17℃에서 24시간 순치 후 실험을 진행하였다. 넙치의 수정란은 사란(死卵)을 분리하여 제거하고 표층에 떠 있는 수정란만을 실체현미경(Stemi 508, Zeiss, Oberkochen, BW, Germany)으로 관찰하면서 건강한 수정란을 발생독성 실험에 사용하였다. 24시간 순치 후 넙치의 발달단계를 현미경으로 관찰하여 Kupffer’s vesicle 단계의 수정란을 사용하였다. 각각의 6-well plate에 멸균해수를 10 mL씩 분주한 뒤 선체청소배출수를 희석배율에 맞게 분주하였다. 선체청소배출수 시료는 원수(W)와, 실험실 여과 선체청소배 출수(LF)로 구분되어 있으며, 전체 배양액 양의 10배, 100배, 1000배의 농도가 되도록 희석하여 노출하였다. RNA 추출을 위한 실험구는 수정란을 약 150개씩 분주하였고, 선체청소배출수 노출 6시간 후 RNA 추출용 실험구에서 넙치 배아를 회수하여 media를 제거한 뒤, ISOGEN (Nippon gene, Toyama, Japan) 500 μL를 추가하여 샘플링을 한 뒤 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다. 실험구는 수정란을 약 50개씩/9-well 분주하여 배양기에서 48시간 동안 17℃로 배양하였다. 모든 실험은 3반복으로 진행하였으며, 기형 관찰 실험구는 선체청소배출수 노출 24시간 후, 모든 실험구에서 사란과 생존율을 기록한 뒤, 사란을 제거하였고, 노출 용액의 절반을 새로 교체하였다. 노출 48시간 경과 후 각각의 실험구에서 형태학적 기형(심장부종, 척추만곡, 꼬리지느러미기형, 발달지연)을 실체현미경(Stemi 508, Zeiss, Oberkochen, BW, Germany)으로 관찰하여 기록하였다.

5. 형태발생 관련 유전자 발현 분석

RNA 추출은 조직마쇄기(Chemglass life sciences, New Jersey, USA)를 이용하여 마쇄한 뒤, chloroform (Sigma– Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 isopropanol (Sigma– Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 ISOGEN protocol에 따라 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA는 Nanodrop ONE(Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, USA)을 사용하여 260 ㎚와 280 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 RNA의 QC를 확인하였다. 추출한 RNA의 일부는 전사체 분석을 진행하였고, 나머지 RNA는 cDNA를 합성하여 RT-qPCR로 형태발생 관련 유전자의 발현을 분석하였다. 넙치의 형태발생 관련 유전자는 심장형성관련 유전자(nkx2.5, NK2 homeobox 5; SOX6, SRY-box-containing gene 6; robo1, roundabout guidance receptor1), 척추형성관련 유전자 (bmp4, bone morphogenetic protein 4), 지느러미 형성관련 유전자(plod2, procollagen-lysine; furin, furin, paired basic amino acid cleaving enzyme; wnt3a, Wnt family member 3a), 종양관련 유전자(TP73, tumor protein p73)를 선별하여 정량하였다(Table 1). qRT-PCR은 QuantiNova™ SYBR Green PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany)와 Rotor-gene Q (Qiagen, Germany)를 이용하여 분석을 진행하였다. 발현된 mRNA는 CT method (2^-ΔΔCt method)를 따랐으며 Roto-Gene Q (Qiagen, Hilden, Germany)으로 정량하였다.

6. 전사체 분석

전사체 분석은 W 실험구 100배 희석농도구와 LF 실험구 100배 희석농도구를 비교 분석하였다. 전사체 분석을 위한 RNA quality 는 RNA integrity number (RIN) 값이 7.5 이상임을 확인한 후 샘플들을 실험구별로 pooling하여 cDNA library를 제작하였다. Oligo dT를 이용하여 mRNA를 분리한 뒤, TruSeq RNA Sample Prep kit (Illumina, San diego, USA)를 이용하여 cDNA library를 제작하였고, 제작된 cDNA library는 Illumina 3000 (Illumina, USA)을 이용하여 100 bp 길이로 RNA sequencing을 진행하였다. RNA sequencing 결과는 FastQC를 통해 quality를 확인하였고, Q값의 평균이 30 이상인 read들을 clean read로 분류하였다. TopHat을 이용하여 NCBI에 등록 되어 있는 넙치 reference genome(Shao et al., 2017)에 clean read들을 mapping하였고, Cufflinks를 이용하여 각 유전자별 read들을 계산하여 보정하였다. Cufflinks를 이용하여 FPKM값과 RPKM값을 처리구/Control로 계산하여 Log₂ (fold-change)값으로 각 유전자의 발현량을 표현하였고, Benjamini-Hochberg 방법을 통해 유의확률(P-value)을 계산하여 P-value<0.05인 유전자들을 differentially expressed genes (DEGs)로 나타내었다. DEGs 확인 후 Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID)를 사용하여 GO (Gene Ontology) term 분석을 진행 하였으며, 각 실험구별로 P-value<0.05인 DEGs를 cutoff로 하여 분석을 진행하였다. 각각의 GO term은 QuickGO의 Ancestor chart를 확인하여 각 pathway 별로 구분하였다.

7. 통계 분석

본 연구에서 통계처리는 R-소프트웨어(R-project, version 4.0.2, R Development Core Team, University of Auckland, Auckland, New Zealand)를 사용하였다. 사망률, 기형발생률, 유전자발현 분석의 결과값은 모두 평균과 표준편차(mean ± SD)로 제시하였다. 실험구 사이의 유의차 여부는 모두 ANOVA test를 진행하여 Tukey’s HSD test로 평균 간의 유의성(p<0.05) 을 검정하였다.

결과 및 고찰

1. 선체청소배출수 화학농도 및 SEM 이미지

방오도료 입자를 관찰한 SEM 이미지는 Fig. 1과 같다. 방오 도료입자는 다양한 크기의 불규칙한 형태로, 선체청소배출수에 다량으로 존재하였으며(Fig. 1-a), 규조류 등의 미세조류 (microalgae)도 함께 혼재하고 있는 것을 확인하였다(Fig. 1-b). 미세조류는 방오도료 입자에 함께 붙어있었으며, 생물학적 부착된 것이 제거 과정을 통해 혼합된 것으로 확인된다. 선체 청소배출수의 화학분석에서 구리(Cu)의 농도는 4315 μg/L로 검출되어 가장 높게 나타났으며, 그 다음으로는 철(Fe)이 2715 μg/L로 농도가 높았다. 아연(Zn)의 농도는 156 μg/L로 검출되어 세번째로 높은 농도였으며, 그 외의 나머지 금속은 미량으로 존재하였다(Fig. 1-c). 이전의 연구(Shin et al., 2022)에서 robot 시스템으로 청소한 선체청소배출수의 구리 농도는 522.81 μg/L 과 818.54 μg/L로 보고되고 있어, 본 연구에서 채집된 다이버로 청소한 선체청소배출수의 구리 농도가 5배-8 배이상 높게 용출된 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 이전 연구에 채집한 배에서 검출된 선체청소배출수의 주성분 방오도료가 아연이었고, 농도가 40523.59 μg/L와 43907.83 μg/L로 나타나 선박에 따라 처리된 방오도료가 상이한 결과를 확인할 수 있었다. 따라서, 선박의 국적, 운항기록, 방오도료의 혼합법, 청소의 방법에 따라 유출되는 혼합 방오도료의 화학물질의 종류와 농도는 큰 차이를 보일 수 있으며 이에 노출된 생물 영향도 상이 할 것으로 생각된다.

일반적으로 구리는 무척추동물의 성장을 제어하기 위해 방오 도료의 활성 물질로 널리 사용된다(Yebra et al., 2004). 일반적으로 부스터 살생물제와 결합된 구리 기반 제제는 해양 생물의 집락형성을 억제하는 효능이 보고되었다(Lagerström et al., 2018). 아연은 다른 살생물제의 혼합물, 특히 구리 함량이 낮은 제제에서 대체제로 적극 사용된다(Ytreberg et al., 2016;Egardt et al., 2017). Lee et al. (2018a)은 대한민국 주요 항구와 해안 지역의 해수 및 퇴적물의 구리와 아연의 농도를 모니터링하였다. 2013년 해수와 퇴적물의 구리 농도는 각각 9.39 μg/L와 19.46 μg/g였고, 아연의 농도는 해수에서 평균 45.79 μg/L, 퇴적물에서 148.48 μg/g로 구리 농도보다 높았다. 본 연구에서 측정된 구리의 농도는 실제 해양환경의 퇴적물 농도보다 200배 이상 높은 농도였고 해수보다 400배 이상 높은 고농도가 이는 지속적으로 고농도의 구리와 아연이 선체청소배 출수 방류로 인해 해양환경으로 유출된다면, 환경내 다양한 해양 매질에 오염이 증가될 수 있음을 보여주고 있다.

2. 선체청소배출수에 노출된 넙치 배아의 형태발생기형영향

선체청소배출수에 넙치 배아를 48시간 노출시킨 결과, 사망률은 W 노출 실험구와 LF 노출 실험구 모두 대조구와 통계적으로 차이가 없었다(Fig. 2-a). 넙치 배아 발생독성영향의 현미경 관찰 결과는 Fig. 2-b에 나타냈다. 심장부종은 LF의 100배와 10배 희석농도구에서 40 ± 5%와 43 ± 10%로 대조구보다 유의하게 높게 나타났다(Fig. 2-c). 척추만곡은 W의 1,000배와 100배 희석농도구에서 48 ± 6%과 28 ± 2%로 대조구보다 유의하게 높았다(Fig. 2-d). 꼬리지느러미 기형은 모든 실험구에서 대조구와 차이를 나타내지 않았으며(Fig. 2-e), 발달지연은 대조구를 제외한 모든 실험구에서 증가하는 경향이었으며, 특히 W의 10배 희석농도구에서 74 ± 13%로 가장 높았다(Fig. 2-f). 아연과 구리의 농도가 높은 선체청소배출수에 노출된 넙치 배아의 발달에서 심장부종, 꼬리지느러미기형, 척추만곡의 빈도가 높게 발생하였다(Choi et al., 2020;Shin et al., 2023). 구리와 아연 단일 물질에 노출된 rare minnow (Gobiocypris rarus)에서 심장부종과 척추만곡 등의 비정상적인 발달을 확인하였으며(Zhu et al., 2014), 구리에 노출된 marine medaka (Oryzias melastigma) 배아의 발달에서 심장 부종, 척추만곡, 꼬리지느러미 기형, 눈 기형 등이 관찰되었다 (Whang et al., 2020). 또한 zebrafish (Danio rerio)의 연구에서는 구리가 발생독성효과를 유의하게 유도한다고 보고하였다 (Johnson et al., 2007). 본 연구의 결과에서도 척추만곡과 심장부종의 기형이 두드러지게 나타났으며, 특히, W 그룹의 10배 희석농도구에서 발달지연을 높게 관찰할 수 있었다. 형태발생 빈도 결과를 통해 선체청소배출수 원수와 필터한 선체청소배출수 사이의 기형 빈도 차이를 유의하게 확인할 수 없었으며, 이는 모든 실험구 선체청소배출수 내의 혼합된 화학금속이 넙치 배아의 발달에 부정적인 영향을 주었음을 예상할 수 있다. 선체청소 배출수에 노출된 넙치 배아의 형태발생 관련 유전자의 발현변화는 Fig. 3과 같았다. 심장형성 관련 유전자인 nkx2.5는 W의 10배, LF의 10배 희석농도구에서 발현이 각각 1.57 ± 0.19배, 1.34 ± 0.06배 증가하여 대조구와 통계적으로 유의한 차이를 보였다(Fig. 3-a). SOX6는 W의 10배 희석농도구에서 발현이 1.68 ± 0.20배 증가하여 선체청소배출수에 영향을 받는 것을 확인되었고(Fig. 3-b), robo1은 LF의 1000배, 100배 희석농도 구간에서 발현이 크게 감소하였다(Fig. 3-c). 골격형성관련 유전자 bmp4는 W의 10배, LF의 10배 희석농도구에서 각각 1.60 ± 0.03배, 1.52 ± 0.06배 발현이 증가하였다(Fig. 3-d). 꼬리 지느러미 형성 관련 유전자 plod2는 LF 실험구 모두 대조구보다 감소한 결과를 나타내었다(Fig. 3-e). furin은 W의 10배 희석농 도구에서 1.31 ± 0.11배로 발현이 증가하였으며(Fig. 3-f), wnt3a는 W의 1000배 희석농도구를 제외한 대부분의 실험구에서 발현이 감소하는 경향을 나타내었으며, LF의 100배 희석농 도구에서는 0.65 ± 0.08배로 발현이 유의하게 감소하였다 (Fig. 3-g). 종양 관련 유전자 TP73은 W의 10배 희석농도구에서 발현량이 1.66 ± 0.09배로 가장 크게 증가하였다(Fig. 3-h). 본 연구의 결과에서 넙치 배아의 형태발생 기형도 유의하게 나타나고 관련하여 유전자 발현의 변화도 확인할 수 있었다. 이전의 구리 및 아연 기반의 청소배출수 화학혼합물에 노출된 넙치 배아의 유전자 발현결과에서 유사한 형태발생 관련 유전자들의 발현 변화를 확인한 결과를 보고하였으며(Choi et al., 2020;Shin et al., 2023), 유의하게 발현이 감소 또는 증가된 형태발생 관련 유전자들의 발현 변화는 최종적으로 넙치 조직형성에 영향을 미쳐 생존에도 유효한 영향을 미칠 수 있을 것으로 생각된다. 본 연구에서 노출시킨 구리 우세한 선체청소배출수 노출된 넙치 배아를 비교하였을 때 이전에 Shin et al. (2022)이 보고하고 있는 아연 성분이 우세한 선체 배출수의 경우 다양한 희석농도에서 심장 부종이 증가된 것으로 보고하고 있어 선체에서 유출되는 방오도료 물질에 따라 다양한 조직발생에 다른 부정적 영향을 미칠 수 있음을 보여주고 있다.

3. 선체청소배출수에 노출된 넙치 배아의 전사체 발현 변화

RNA-sequencing 후 모든 분석그룹에 대한 transcriptome data의 raw read 수, clean read 수, GC(%), Q20(%), Q30(%), mapped read 수를 파악하였다(Table 2). 대조구는 56,552,006개의 raw read를 얻었으며, 그 중에서 clean read의 수는 56,206,580개로 99.39%의 비율로 얻어졌다. GC content(%)는 50.53%이었으며, 염기서열 정확도 점수 30이상을 갖는 염기의 비율(Q30, %)은 95.53%로 확인되었다. Mapped reads는 reference에 mapping된 read의 개수이며, 46,250,724개의 read가 81.78%로 mapping되었다. W 실험구는 44,165,480개의 raw read를 얻었으며, 그 중에서 clean read의 수는 43,723,036개로 99.0% 비율로 얻어졌다. GC(%)는 50.71, Q30(%)은 98.36이며, mapped read의 비율은 82.63%이다. LF 실험구는 50,991,970개의 raw read를 얻었으며, 그 중에서 clean read의 수는 50,656,912개로 99.34% 비율로 얻어졌다. GC(%)는 49.71, Q30(%)은 98.32 이며, mapped read는 86.53%로 나타났다. DEGs 분석 결과 NC vs W 실험구에서 249개의 DEGs가 높게 발현되었고, 175개의 DEGs가 낮게 발현되었다. NC vs LF 실험구에서는 226개의 DEGs가 높게 발현되었고, 200개의 DEGs가 낮게 발현되었다(Fig. 4-a). NC vs W와 NC vs LF 실험구의 DEGs set으로 벤다이어그램을 확인한 결과, NC vs W에서 차별적으로 발현되는 DEGs는 318개이고, NC vs LF에서 차별적으로 발현되는 DEGs는 320개이며, 공통적으로 발현되는 DEGs는 106개이다(Fig. 4-b).

벤 다이어그램을 통해 확인한 DEGs의 기능을 이해하기 위하여 GO term enrichment 분석을 수행하였다(Fig. 5). W 실험구에서 차별적으로 발현된 318개의 DEGs는 Nervous system development, Cell development, Neuron development, Cell morphogenesis, Transport, Cell communication과 관련된 GO term이 확인되었다(Fig. 5-a). LF 실험구에서 차별적으로 발현된 320개의 DEGs는 Animal organ development, Transport, Cell development, Nervous system development, Cell communication과 관련된 GO term이 확인되었다(Fig. 5-b). W와 LF 실험구에서 공통적으로 발현된 DEGs 106개는 Muscle development, Animal organ development, Cell development, Heart development와 관련된 GO term이 확인되었다(Fig. 5-c).

이전의 연구에 따르면, 구리와 아연의 농도가 높았던 선체청 소배출수에 노출된 넙치 배아의 전사체 분석 결과, 근육발달, 신경계발달, 세포발달, 세포신호전달과 관련된 유전자들이 차별적으로 발현되었다(Choi et al., 2020;Shin et al., 2023). 또한 선체청소배출수에 노출된 marine mysid (Neomysis awatschensis)는 사망률 증가, 성장지연, 번식감소 등의 결과를 나타냈으며, 선체청소배출수의 잠재적인 피해를 강조하였다 (Lee et al., 2024b). 구리에 노출된 zebrafish 배아는 신경발생 및 근육형성 과정동안 결함을 일으키며, 관련 유전자의 차별적인 발현을 확인하였다(Zhang et al., 2015). W와 LF 실험구에서 공통적으로 차별 발현된 유전자 106개의 GO 분석 결과에서는 Muscle development와 Heart development가 특징적으로 확인되었다. 이러한 결과는 앞선 기형관찰에서 심장부종 및 척추만곡의 빈도가 모두 두드러지게 나타난 것과 관련이 있을 것으로 예상되며, 이러한 연구결과는 선체청소배출수의 생태계 오염으로 인한 어류의 발생학적 영향을 보여주고 있다.

GO term enrichment 분석을 통해 확인된 결과를 대상으로 gene network 분석을 수행하였다(Fig. 6). 318개 DEGs의 W 실험구에서는 97개의 DEGs가 gene network 분석에 사용되었다(Fig. 6-a). Kmt2d associates with Lysine(K)-specific demethylase 6a (Kdm6a)를 포함하여 14개의 DEGs는 Nervous system development pathway이며, Kdm6a는 zebrafish에서 초기 발달단계에서 머리 골격 및 심장발달을 위해 유전자 발현을 조절한다고 밝혀졌다(Sen et al., 2020). Orthopedia a (otpa)를 포함한 6개의 DEGs가 Neuron development pathway이며 otpa는 zebrafish에서 시상하부 뉴런의 발달에 중요하게 작용한다고 알려져 있다(Ryu et al., 2007). Oculocutaneous albinism 2 (oca2)를 포함한 9개의 DEGs는 Cell development pathway이며, oca2는 포유류 및 어류의 멜라닌 생성 전반에 걸쳐 기능을 하며, 세포내 수송에도 역할을 한다고 보고되었다(Beirl et al., 2014). Contactin2 (cntn2)를 포함한 16개의 DEGs는 Cell morphogenesis pathway이며, cntn2는 포유류의 신경세포이동과 축삭 연축(axon fasciculation) 역할을 하고, zebrafish의 뉴런이동, 핵의 축삭 안내의 기능이 밝혀졌다(Gurung et al., 2018). 또한 본 연구와 유사하게 선체청소배출수에 노출된 넙치 배아에서도 cntn2가 핵심 유전자로 제시하였다(Shin et al., 2023). WNK lysine deficient protein kinase 1b (wnk1b)를 포함한 28개의 DEGs는 Cell communication pathway이며, wnk1b는 zebrafish 배아에서 혈관 신생과 관련이 있다고 보고되었다 (Lai et al., 2014). Nitric oxide synthase (nos1)를 포함한 24개의 DEGs는 Ion transport pathway이며, nos1은 turbot (Scophthalmus maximus L.)의 선천성 면역반응에 중요한 역할을 한다고 보고되었다(Dong et al., 2016).

320개 DEGs의 LF 실험구에서는 167개의 DEGs가 gene network 분석에 사용되었다(Fig. 6-b). Histone deacetylase 4 (Hdac4)를 포함하여 31개의 DEGs는 Anatomical structure development pathway이며, hdac4는 zebrafish에서 머리 골격 형성 및 발달과 관련이 있으며, hdac4 유전자의 발현량에 따라 머리 골격의 기형변화를 확인하였다(DeLaurier et al., 2012). Cache domain-containing 1 (cachd1)를 포함하여 34개의 DEGs는 Ion transport pathway이며, cachd1은 zebrafish 뇌 발달에 중요한 역할을 하는 Wnt pathway의 구성 요소로 확인되었다(Powell et al., 2024). Connective tissue growth factor a (ctgfa)를 포함하여 23개의 DEGs는 Cell differentiation pathway이며, ctgfa는 세포의 증식, 이동, 부착 및 세포외기질의 구성에 관여하며(Leask and Abraham, 2006), 이는 배아의 발생, 혈관 신생에서 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다(Lau and Lam, 1999). Zebrafish와 Wuchang bream에서는 ctgfa, ctgfb 두가지가 존재한다고 밝혀졌으며, zebrafish에서는 배아 발생기간동안 심장과 혈관계 발달에서 발현되었다(Fernando et al., 2010). Apoptosis-inducing factor (aifm1)를 포함한 34개의 DEGs는 Cell communication pathway이며, aifm1은 세포사멸과 관련된 유전자로 zebrafish 배아에서 마취제인 ketamine에 노출되었을 때 유전자 발현의 변화가 확인되었다(Felix et al., 2017). Muscle segment homeobox 1a (msx1a)를 포함한 45개의 DEGs는 Nervous system development pathway이고 msx1a는 쥐에서 신경분화를 억제하고 세포주기를 조절하며, 신경관 발달에서 세포사멸을 유도하는 유전자로서 페인트 입자가 제거된 용존화합물질의 노출만으로 이러한 영향을 일으킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다(Liu et al., 2004).

W와 LF 실험구에서 공통으로 발현된 106개의 DEGs 중에서 48개의 DEGs가 gene network 분석에 사용되었다(Fig. 6-c). Ryanodine receptor 1b (ryr1b)를 포함한 10개의 DEGs는 muscle cell development pathway이었다. Ryanodine receptor 1 (ryr1) 돌연변이는 인간에게서 선천성 근육병의 일반적인 원인으로 알려져 있으며, Zebrafish에서 ryr1b의 결핍은 골격근의 기능에 영향을 주며, 이는 ryr1b가 근육기능과 영향이 있다는 것을 알 수 있다(Gupta et al., 2013). Regulator of G protein-signaling 9b (rgs9b)를 포함한 19개의 DEGs는 Anatomical structure development pathway와 연관성을 가지며, rgs9b는 zebrafish에서 눈의 빛 감지 능력과 관련유전 인자로 비정상적인 유전자발현의 변화는 광 반응 회복의 민감도에 영향을 미친다고 보고되었다(Dong et al., 2022). Calmodulinregulated spectrin-associated protein family, member 2a (camsap2a)를 포함한 11개의 DEGs는 Cell development pathway와 연관된 유전자로서, camsap2a는 zebrafish 배아에서 미세소관 비대칭성과 endosome의 운동성과 관련이 있다고 보고되었다(Richard et al., 2024). 그리고 Natriuretic peptide receptor 3 (npr3)를 포함한 8개의 DEGs는 Heart development pathway에 속해있으며, npr3는 신장, 심혈관, 신경 및 다양한 세포 및 생리학적 과정에도 관여한다고 보고되었다(Gong et al., 2018).

본 연구에서 구리가 우세한 선체청소배출수에 노출된 넙치 배아는 W와 LF 실험구의 큰 차이없는 아치사 수준의 독성영향 결과를 확인하였다. 구리로 오염된 퇴적물에 노출된 medaka (Oryzias latipes) 배아는 골격 및 심혈관 발달 이상과 DNA 손상을 나타냈다고 보고되었다(Barjhoux et al., 2012). 또한 5-20 μg/L 농도의 구리에 노출된 killifish (Poecilia vivipara)는 생존율이 감소되고 에너지대사에 변화가 생겼다(Abou anni et al., 2019). 이러한 결과를 통해 선체청소배출수가 넙치 배아의 발달단계에서 형태형성에 잠재적인 영향인자로 작용할 수 있음을 알 수 있다.

비록 본 연구에서 선체청소배출수의 주요화학적 오염인자인 구리와 아연의 영향을 기술하였으나, 일반적인 유기 살충제를 비롯한 다양한 화학물질간의 상호작용이 생물에 대한 독성영향을 증가 또는 변형 시킬 수 있으므로 이에 대한 추가연구가 필요하다. 넙치 배아는 선체청소배출수로 인해 영향을 받을 수 있는 비표적 생물이다. 선체청소배출수 내의 방오페인트 입자를 포함한 화학혼합물은 해양환경에 위험을 줄 가능성이 높을 뿐 아니라 본 연구를 통해 구리의 조성이 우세한 선체청소배출수는 입자를 제거한 용존된 선체배출수 만으로도 넙치의 발생독성 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 연구의 결과는 선체청소배출수가 해양 환경의 오염 및 생태계 서식 생물의 독성 영향에 대한 위험성을 강조하며, 지속적인 관리 및 규제를 마련하는데 과학적 근거로 제시할 수 있을 것으로 생각된다.