서 론
흰다리새우(Litopenaeus vannamei)는 광염성 종으로 1~40%의 염분 범위에서 생존이 가능하여 해수와 담수 조건 모두에서 양식이 가능하다(Abdelrahman et al., 2019). 광염성의 생리학적 특성을 가지고 있는 흰다리새우는 경제성이 높아 전 세계적으로 가장 많이 양식되는 새우 중 하나이다. 국내 전통적인 새우 양식품종인 보리새우 및 대하 양식의 경우 흰반점병(white spot disease, WSD)과 같은 바이러스성 질병에 대한 내성 약화의 문제로 인해 WSD에 내성이 강한 흰다리새우를 양식품 종으로 대체하였다(Jang and Jun, 2005;Jang et al., 2008). 흰다리새우 양식품종으로의 장점은 WSD에 강한 내성뿐만 아니라 다른 새우품종과 비교하여 높은 성장율, 저단백질 요구량, 낮은 공식률, 강한 환경내성 및 SPF(Specific Pathogen Free) 생산이 가능한 장점이 있다(Lotz, 1997;Briggs et al., 2004;FAO, 2006;Lightner et al., 2009).
흰다리새우 양식장의 환경적 요인으로는 수온과 염도의 안정적인 유지가 이루어지며, 청정수의 공급이 이루어지는 수질오염이 없는 지역이 좋다. 새우의 성장 및 생존은 수질상태에 영향을 받으므로 적정 pH 및 용존산소의 유지가 중요하며, 또한 유기물이나 암모니아 농도가 높지 않도록 수질 관리가 필요하다.
우리나라의 새우양식은 남해안과 서해안 지역을 중심으로 축제식양식이 발달하였다. 그러나 노후화된 양식시설 및 폐쇄적이고 정체된 해역에 주로 존재하는 특성에 의해 양식장의 환경이 열악한 상태이다. 환경 및 질병 내성에 강한 흰다리새우 역시 폐사율이 높아 생산성은 감소하는 상황이다. 따라서 양식장 사육수의 수질 관리는 매우 중요하다.
흰다리새우 양식장에서 미생물은 수질 관리와 새우의 건강 유지에 중요한 역할을 한다. 미생물의 활용은 양식장 환경의 개선 및 생산성 효율을 높일 수 있다. 대표적으로 바이오플락 미생물 (biofloc microorganisms)의 활용이다. 암모니아(NH3)와 아질산염(NO2)을 질산염(NO3)으로 전환 하여 수질을 안정화시키며, 유기물을 분해하며, 일부 미생물은 단백질원이 되어 새우의 먹이원으로 이용이 가능하다. 유산균(lactic acid bacteria)은 새우의 장내 미생물의 균형을 유지하여 건강에 도움을 준다. Rhodopsudomonas 및 Rhodobacter 등은 광합성균 (Photosynthetic bacteria)로서 유기물의 분해 및 산소의 공급에 관여한다.
양식장의 양식수에 존재하는 미생물은 양식생물의 성장 및 폐사 등에 영향을 미칠 수 있으므로 양식수에 존재하는 미생물의 분석은 필요하다. 미생물 분석의 방법으로 환경유전체라는 메타게놈(metagenome) 분석 방법을 통하여 환경 시료 내에 존재하는 미생물 군집을 모두 분석하는 연구들이 많이 수행되고 있다(Schmidt et al., 1991; Hoff et al., 2008). 메타게놈 분석법의 경우 미생물 유래의 유용 유전자를 찾거나 활용하는 방법으로 유용한 분석법이다.
본 연구에서는 폐사가 자주 발생하는 여름철 고수온기에 흰 다리새우 양식장의 양식수에 존재하는 미생물을 대상으로 16S rRNA 메타게놈 분석을 시행하여 동정하였다. 이러한 자료를 토대로 흰다리새우 양식장의 환경 및 흰다리새우 성장 및 폐사와 미생물과의 관련성의 연구에 기초적인 자료가 되고자 하였다.
재료 및 방법
1. 흰다리새우 양식장 양식수 수온, 염분, 용존산소(DO), 수소이온농도(pH) 분석
본 연구를 수행한 시기는 2023 년이며, 흰다리새우 양식장은 전라남도 신안군 팔금면 소재 약 5만평의 축제식 양식장이다 (Fig. 1). 양식장의 흰다리새우 성장 및 생존 등과 관련하여 양식 장의 환경 여건을 조사하기 위하여 양식장의 일부를 연구용 목적으로 구분하였고, 연구에 활용할 데이터 수집을 위한 플랫폼을 면적 약 3,000평당 1개를 설치하였다. 전체적으로 5대를 설치하여 활용하였으며, 플랫폼에는 자동측정센서가 설치되어 있어서 수온, 염분, DO, pH의 환경 수치를 실시간 측정하였다 (Fig. 2).
2. 양식수의 채수 및 DNA 추출
흰다리새우 양식장 양식수 16SrRNA 유전자의 메타게놈분석(metagenomic analysis)을 통한 미생물의 조성 분석을 위하여 양식수를 채수하였다. 양식장의 서로 다른 위치 5곳에서 9월에 양식수의 채수가 수행되었고, 채수한 양식수 1L를 펌프를 이용하여 0.22 ㎛ 필터를 통과사켜 미생물을 분리하였다. 미생물이 포함된 필터는 멸균 튜브에 넣어 -20℃에 보관하였다. DNA의 분리는 AccuPrep DNA preparation kit(AccuGene, Korea)를 이용하여 회사에서 제시한 방법에 따라 추출하였다. 순수하게 정제한 DNA는 분광광도계(NanoVue, GE Healthcare)를 이용하여 순도 및 농도를 측정하였다.
3. 16S rRNA 유전자 증폭
메타게놈 분석을 위해 길이가 약 1,500bp이고 보존된 영역 사이에 9개의 가변 영역이 포함되어 있는 원핵생물 16S rRNA 유전자를 분석하였다. 16S rRNA의 가변 영역은 다양한 미생물 집단의 속 또는 종과 같은 계통학적 분류에 사용되며 본 연구에는 16S rRNA 유전자의 가변 V3 및 V4 영역을 분석하였다.
추출 분리한 DNA를 주형으로 forward primer (5'- TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3')와 reverse primer (5‘- GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’)를
이용하여 16S rRNA 유전자의 가변 V3 및 V4 영역인 약 550 bp 크기의 산물을 증폭하였다. 반응 조건은 초기변성단계 95℃ 3분 뒤, 변성단계 95℃ 30초, 결합반응 55℃ 30초, 증폭 반응 72℃ 30초를 총 25회 반응한 뒤 72℃에서 5분간 반응하였다.
4. 미생물 분석
PCR 증폭 산물은 차세대염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS) 라이브러리 준비를 위해 HiAccuBeads (AccuGene, Korea)를 이용하여 회사에서 제시한 방법에 따라 정제하였다. 증폭 산물 라이브러리(library)는 Illumina MiSeq 시스템에서 MiSeq Reagent Kit v3(Illumina, USA)를 사용하여 600회 반복 수행하여 약 100,000정도의 read가 생성되도록 염기서열 분석하였다. 생성한 초기 fastg 파일의 염기서열 분석의 정성(quality) 검사는 FastQC(version 0.11.9)를 사용하여 수행하였다. 생성한 데이터의 전 처리 및 마이크로바이움(microbiome)의 분석은 QIIME2(version 2023.2)를 이용하여 수행하였다. QIIME2에서 DADA2를 사용하여 생성 데이터의 정성 여과(quality filtering) 및 노이즈 제거(denoising) 하였다. 생성된 ASV(amplicon sequence variant)는 분류 분포를 결정하기 위해 SILVA 데이터베이스(version 138.1)를 사용하여 분류하였다(Caporaso et al., 2010;Quast et al., 2013;Callahan et al., 2016;Kim et al., 2023).
결과 및 고찰
본 연구는 흰다리새우 양식장의 양식수에 존재하는 미생물의 조성 및 수질 환경 정화에 관련한 미생물의 존재 유무의 확인 및 미생물의 역할에 대한 연구이다.
1. 흰다리새우 양식장 양식수 수온, 염분, 용존산소(DO), 수소이온농도(pH) 분석
흰다리새우 양식장 양식수의 월별 수온, 용존산소(DO), 수소 이온농도(pH) 및 염분 등은 Table 1에 나타내었다. 조사기간인 2023년 5월부터 9월까지의 수온의 변화는 계절의 경과에 따라 수온은 상승하는 현상으로 나타났다. 수온의 측정은 자동측정센서가 실시간으로 측정하는 측정치를 해당 월별 상순, 중순 및 하순으로 나누어 평균 온도를 제시하였다. 5월 상순(1일- 10일), 중순(11-20일) 및 하순(21-30일)의 수온은 16.4℃, 17.0℃, 19.1℃로 나타났다. 6월 상순, 중순 및 하순의 수온은 20.5℃, 21.5℃, 22.4℃로 나타났다. 7월 상순, 중순 및 하순의 수온은 24.4℃, 24.7℃, 25.5℃로 나타났다. 5월부터 7월 하순까지의 수온 변화의 특징은 계절이 봄에서 여름으로 경과하는 시기에서 7월의 수온이 6월과 비교하여 2℃정도 상승의 현상을 나타내었다. 6월 하순 22.4℃와 7월 상순 24.4℃를 비교하면 2℃ 정도 상승하였다. 7월의 상순, 중순 및 하순을 비교하면 최대 1.1℃ 상승을 보였다. 8월의 수온은 상순, 중순 및 하순의 수온이 25. 5℃, 25.4℃, 25.4℃로 나타났다. 8월의 상순, 중순 및 하순의 수온 변화는 0.1℃로 거의 변함이 없는 것으로 나타났다. 9월의 상순, 중순 및 하순의 수온은 23.3℃, 23.4℃, 22.2℃로 나타났다. 7월 하순의 수온 25.5℃임을 보면 7월 하순 및 8월의 수온은 25.5℃ 정도로 가장 높았다. 그리고 9월 상순의 23.3℃의 수온을 보면 2.2℃ 정도의 낮은 수온의 변화가 나타났다. 수온은 흰다리새우의 생리, 성장, 생존율에 직접적인 영향을 미치는 가장 중요한 환경 요인 중 하나이다(Kim et al. 2017). 흰다리새우 치하를 수온 22℃에서 31℃ 정도에서 사육을 시켰을 경우의 생존율을 조사하였을 때 92.4%에서 97.8% 정도의 생존율을 보였고 특히 28℃에서 97.8%의 높은 생존율을 나타낸다는 보고가 있다(kim and Kang 2022). 따라서 조사 시점의 수온은 흰다리새우 생존에는 적합한 수온이라 판단된다.
해양에서의 표준 염분은 일반적으로 대략 33‰-34‰으로 한다. 염분은 해양생태계에 서식하는 생물들에게 중요한 환경요인으로 생리적 및 생태적으로 영향을 주어 성장, 항상성 유지, 대사 및 분포에 관여한다고 알려져 있다(Hammond, 1983;Beckmann et al., 1990;Weirich and Tomasso, 1991;Dame, 1996: Boeuf and Payan, 2001: Marshall, 2002;Matthews and Fairweather, 2004). 이전의 보고에 의하면 흰다리새우는 1‰-40‰의 염분 범위에서 생존이 가능하다고 알려져 있다(Abdelrahman et al., 2019). 자동측정센서를 이용하여 실시간으로 측정한 염분 측정치를 해당 월별 상순, 중순 및 하순으로 나누어 평균 염분을 제시하였다. 2023년 5월부터 9월까지의 염분의 변화는 30.5‰에서 33.5‰까지 보여주었다. 측정된 염분은 해양의 표준 염분에 속하는 것으로 나타났고, 광염성의 특징을 가지는 흰다리새우의 서식에 있어서도 적절한 농도라 생각한다. 5월 상순, 중순 및 하순의 염분은 32.7‰, 33.2‰, 33.3‰로 나타났다. 6월 상순, 중순 및 하순의 염분은 33.1‰, 32.7‰, 30.5‰로 나타났다. 7월 상순, 중순 및 하순의 염분은 30.8‰, 31.4‰, 30.6‰로 나타났다. 6월 하순부터 7월까지의 염분은 다른 시기에 비하여 낮게 나타났다. 8월의 염분은 상순, 중순 및 하순의 염분이 31.4‰, 32.9‰, 33.0‰로 나타났다. 9월의 상순, 중순 및 하순의 염분은 31.9‰, 32.8‰, 33.5‰로 나타났다. 8월과 9월의 염분은 비슷한 양상을 나타내었다.
용존산소(DO)는 물속에 녹아 있는 산소의 양을 의미하며, 양식 생물의 호흡, 수질 상태, 미생물 활동 및 질병 발생에 영향을 미친다(Kim and Lee, 2004). 양식생물은 용존산소를 이용하여 에너지를 생성하는데 용존산소가 낮아지면 저산소증 (hypoxia)이 발생하며, 이는 스트레스, 면역력 저하, 성장 지연 및 폐사를 초래할 수 있다(Kim and Lee, 2004: Shin et al., 2013). 양식생물은 5 mg/L-8 mg/L의 용존산소를 필요로 한다. 적절한 용존산소 농도는 양식장 생태계 내 미생물 군집의 건강과 균형 유지에 필수적이라고 알려져 있다(Yoo et al., 2003). 또한 적절한 용존산소의 농도 유지는 호기성 미생물을 활성화하여 유기물을 분해하고 질소순환을 촉진하며, 용존산소 농도의 부족시에는 혐기성 미생물이 활성화되어 암모니아, 황화 수소 등 독성 물질이 축적 및 물의 산화환원 전위를 낮추어, 수질 악화를 초래할 수 있다(Yoo et al., 2003: Park and Lee, 2008). 실시간 자동측정센서를 이용하여 측정한 용존산소 측정치를 해당 월별 상순, 중순 및 하순으로 나누어 평균 용존산소 측정치을 제시하였다. 2023년 5월부터 9월까지의 용존산소의 농도는 최저 7.0 mg/L에서 최고 8.7 ng/L까지 보여주었다. 측정된 용존산소는 양식 생물이 요구하는 용존산소의 범위인 5 mg/L-8 mg/L에 최저 농도인 7.0 mg/L이 포함되어 있어서 양식장 양식수의 용존산소 함유는 정상적이라 판단한다. 5월 상순, 중순 및 하순의 용존산소는 8.3 mg/L, 8.3 mg/L, 8.5 mg/L로 나타났다. 6월 상순, 중순 및 하순의 용존산소는 8.3 mg/L, 8.0 mg/L, 7.4 mg/L로 나타났다. 7월 상순, 중순 및 하순의 용존산소는 7.3 mg/L, 7.0 mg/L, 7.0 mg/L로 나타났다. 8월의 용존산소는 상순, 중순 및 하순에서 7.3 mg/L, 7.0 mg/L, 7.2 mg/L로 나타났다. 9월의 상순, 중순 및 하순의 용존 산소는 7.2 mg/L, 7.1 mg/L, 7.8 mg/L로 나타났다. 조사시기 월별의 용존산소의 측정치를 살펴보면 5월의 용존산소 측정치가 상순, 중순 및 하순에서 각각 8.3 mg/L, 8.3 mg/L, 8.5 mg/L로 나타나 다른 조사시기에 비하여 높게 나타났다. 6월 하순 용존산소가 7.4 mg/L로 나타나기 시작하여 9월 중순까지 비슷한 수준을 유지하다가 9월 하순, 7.8 mg/L로 반등하였다.
양식장의 양식수의 pH는 양식 환경의 안정성과 양식 생물의 건강 및 성장에 영향을 미치는 주요 수질 지표 중 하나이다. 양식수의 pH는 산성도나 알칼리성을 나타내며, 양식 생물의 조직 및 혈액내의 산염기의 균형에 영향을 미쳐 대사작용에 영향을 미치며, 또한 미생물의 질산화 및 유기물 분해 효율에 pH가 중요하다 알려져 있다(Claude et al., 2011). 일반적으로 양식장의 pH는 6.5-8.5 정도를 유지 해준다. 실시간 자동측정 센서를 이용하여 측정한 pH 측정치는 월별 상순, 중순 및 하순으로 나누어 평균 pH 측정치을 나타내었다. 2023년 5월부터 9월까지의 pH는 최저 8.3에서 최고 8.6까지 보여주었다. 5월 상순, 중순 및 하순의 pH는 8.5, 8.5, 8.5로 나타났다. 6월 상순, 중순 및 하순의 pH는 8.6, 8.6, 8.6로 나타났다. 7월 상순, 중순 및 하순의 pH는 8.5, 8.3, 8.3로 나타났다. 8월의 pH는 상순, 중순 및 하순에서 8.4, 8.3, 8.6로 나타났다. 9월의 상순, 중순 및 하순의 pH는 8.5, 8.4, 8.4로 나타났다. 조사시기 월별의 pH의 측정치를 살펴보면 5월의 pH는 상순에서 하순까지 전부 8.5를 보여주었고, 6월에는 8.6을 나타내었다. 7월 중순부터 8월 중순까지 pH가 낮아지너니 8월 하순부터 반등하기 시작하였다.
연구 대상으로 지정한 전라남도 신안군 팔금면 소재의 흰다리새우 양식장의 치하의 입식 후부터 생산의 단계 전까지 양식수 수질 및 수온은 적합한 상태인 것으로 생각한다.
이러한 수질의 상태에서 양식수에 서식하며 활동하는 미생물의 조성은 어떻게 이루어져 있으며, 수질의 정화 및 질소 순환에 관여하는 미생물들이 존재하는지에 대하여 조사하였다.
2. 흰다리새우 양식장 양식수 미생물 조성 분석
흰다리새우 양식장 양식수에 존재하는 원핵생물 미생물을 분석하기 위하여 시료를 채수하였으며, 채수 시기는 9월이며. 양식수의 수질 환경은 수온(22.2~23.3℃), DO(7.1~7.8 mg/L), pH(8.4~8.5) 및 염분(31.9~33.5‰)등을 나타내었다. 양식수를 대상으로 16SrRNA 유전자를 분석한 결과 800여 속 정도가 조성되어 있는 것으로 나타났다. 분석된 미생물의 분류군은 Fig. 3에 나타내었다. 분석한 미생물에는 해양생태계에서 발견되며 극한 환경에 존재하며 기능적으로 질소 순환 및 유기물의 분해에 관여하는 다수의 중요한 미생물 및 프로바이오틱스(유산균) 들이 존재하였다. 그 중에서 양식장 양식수에서 발견한 질소 순환 및 유기물 분해에 관여하며 우점으로 조성되어 있는 미생물들을 확인하였다(Fig. 4, 5).
Lewinella_nigricans 종은 Bacteroidota문에 속하는 그람 음성 세균 종으로 세포는 일반적으로 실모양이며 유연한데, 이는 이 속의 다른 종들에서도 흔히 볼 수 있는 특징이다. 이 세균은 호기성이며 종속영양생물로, 성장에 산소를 필요로 하며 유기 화합물로부터 에너지를 얻으며, 주로 해양 퇴적물에서 발견된다 (Lee, 2007)(Fig. 5A). Oceanicola sp.는 Rhodobacteraceae 과에 속하며 Proteobacteria 문에 속하는 그람 음성 세균 속으로 해수 및 해양퇴적물 등의 해양 환경에서 발견된다. 일반적으로 호기성이며, 종속영양생물로 해양 탄소 순환 및 유기화합물로부터 에너지를 얻는 과정을 통해 영양 순환에 중요한 역할을 한다(Cho and Giovannoni, 2004)(Fig. 5B). Nitrospina sp.는 Nitrospinae 문에 속하는 세균 속으로, 주로 해양 환경에서 질소 순환 및 영양 순환에 중요한 역할을 한다. 아질산염(NO2-)을 질산염(NO3-)으로 산화하는 과정에서 중요한 역할을 하여 해양 생태계에서의 질화작용에 필수적이다(Baver et al., 2022)(Fig. 5C). Ruegeria는 그람 음성의 막대 모양 세균으로 Rhodobacteraceae 과에 속하는 세균 속으로, Proteobacteria 문에 속한다. 이 속은 주로 해수 및 해양 퇴적물 등의 해양 환경에서 발견되며, 황 및 탄소 순환에 관여하고, 유기 화합물을 분해하여 에너지를 얻는 종속영양생물로 알려져 있다(Kim et al., 2019)(Fig. 5D). Nitrospira는 그람 음성의 나선형 또는 막대 모양 세균으로 질소 순환에서 중요한 역할을 하는 세균 속으로, 특히 질화 과정에서 중요하다. Nitrospira는 토양, 담수, 해수 등 육상 및 해양 생태계에서 서식한다. 이 세균은 아질산염(NO2-)을 질산염(NO3-)으로 전환하는 데 중요하며, 이는 토양 및 수환경에서 질소 가용성을 유지하는 데 필수적이다(Daims and Wagner, 2018)(Fig. 5E). Rhodopseudomonas는 Rhodobacteraceae 과에 속하는 그람 음성의 막대 모양 세균 속으로, Proteobacteria 문에 속한다. 이 속은 다양한 대사 능력으로 잘 알려져 있으며, 특히 빛이 있는 환경에서 광합성을 수행하면서 유기 화합물을 에너지원으로 활용한다. Rhodopseudomonas 종은 담수 및 해양 시스템을 포함한 다양한 수생 환경 및 토양에서 발견되며, 생물 정화 및 영양소 순환에 관여한다(Brown et al., 2022)(Fig. 5F). Nitrosomonas는 그람 음성이며, 막대 모양 또는 구형의 형태로서 질산화(nitrification) 과정에서 암모니아(NH3)를 아질산염(NO2-)으로 산화시키는 능력이 있어서 암모니아(NH)가 질산염(NO-)으로 전환되는 필수적인 단계에 역할을 한다. Nitrosomonas 종은 일반적으로 토양 질소 순환과 담수 및 해양, 특히 오염된 수역이나 퇴적물과 같은 암모니아(NH3)가 존재하는 환경에서 자생한다고 알려져 있다(Chávez et al., 2023) (Fig. 5G). 연구 결과 흰다리새우 양식장의 사육수에는 질화 및 탈질의 질소 순환에 관여하는 중요 미생들인 Nitrosomonas, Nitrospina, Nitrospira 등 을 확인하였으며, 유기화합물의 분해 등에 관여하는 미생물들이 존재하는 것을 확인하였다. 이러한 미생물들은 양식장 사육수의 수질 정화 등에 관여하여 생물 개체의 성장 및 생존에 영향을 미치리라 생각된다.
현재 양식 산업에서 양식수에의 미생물 활용은 수질 개선, 질병 예방, 양식 생물의 성장 촉진 등 다양한 관점에서 주목받고 있다. 육상 양식 산업에서는 양식수에 함유되어 있는 유기물질 및 항생제 등의 약제 성분의 자연 해양생태계의 유입에 따른 환경오염의 문제가 대두되고 있다. 따라서 양식수의 배출을 억제하기 위한 정책들이 제정되어 있다. 그러나 이를 극복하기 위한 여과순환장치 등의 개발 등은 고가의 비용으로 인해 보급 에의 문제가 있다. 따라서 수질 정화, 양식수 내 영양 순환, 유해 물질 제거, 그리고 병원균 억제 등에서 중요한 역할을 하는 유용한 미생물의 개발 및 적용은 지속 가능한 양식 시스템 구축을 위해 매우 중요하다.
본 연구를 통해 흰다리새우 양식장 양식수에 존재하는 미생 물의 조성 및 기능성 미생물의 확인은 환경 친화적인 양식 시스템을 구현하기 위한 기능성 미생물 군집의 기초적인 자료로 활용 가능하리라 생각된다. 본 연구에서는 9 월 수확시기 전의 양식수의 미생물 확인을 목표로 분석하였다. 그러나 미생물의 성장 및 생존에는 환경요인의 영향을 받을 것으로 생각된다. 추후 계절에 따른 환경요인의 변화에 의한 미생물 군집의 변화를 연구할 필요성이 있다고 생각된다. 이러한 연구를 통해 계절적으로 영향을 받는 기능성 미생물을 확인하고, 인위적인 보충을 통해 지속적인 환경 친화적인 양식 시스템을 개발할 필요성이 있다고 생각한다.